2005.10.10.  
A DNS szerkezete és replikációja  -III.

- DNS felépítés - replikáció mikroszkóposan - a replikáció molekuláris biológiája  - a DNS 50 éve -


   A replikáció vagy reduplikáció a genetikai anyag osztódás előtti megduplázódása, melynek gyorsnak és pontosnak kell lennie. A DNS szintézisét végző első enzimet Arthur Kornberg izolálta E. coli sejteből az 50-es évek végén. Ez volt a E. coli DNS polimeráz I enzime. A tisztított enzim kémcsőben képes volt a jelen lévő DNS megsokszorozására. Azóta számos DNS polimeráz ismert különböző rendszerekből és egyazon szervezetből is.

11-21. ábra: A replikációban részt vevő fehérjék és a replikációs villa felépítése  (E. coli rendszer.)
Az ábra térben kiterítve mutatja a replikációs villát. A valósághoz közelebbi kép a 11-30 ábrán látó.
alkotóelemek:
topoizomeráz
helikáz
SSB fehérjék
primosoma,
primase, DnaB, DnaC, DnaT
priA, priB, priC
primer
DNS polimeráz III
DNS polimeráz I
DNS ligáz

A legtöbb DNS polimeráz működésének elengedhetetlen feltételei :

  • templát szál , mellyel meghatározza a vele komplementer új DNS szál szekvenciáját
  • primer DNS vagy RNS, mely kijelöli az újonnan szintetizálódó szál kezdőpontját. A polimeráz a primer 3' végéhez kapcsolja az első beépítendő bázist. Ha nincs primer (dupla szálú rész), akkor az enzim nem képes a polimerizációt elkezdeni.
  • prekurzor deoxinukleozid trifoszfátok (deoxiadenozin-trifoszfát vagy dATP, deoxicitidin-trifoszfát vagy dCTP , deoxiguanozin-trifoszfát vagy dGTP , deoxitimidin-trifoszfát vagy dTTP, mindet együttesen rövidítve: dNTP


11-22. ábra:

A replikáció soán a DNS polimeráz a készülő lánc 3' végéhez a templát szál szemben lévő bázisával komplementer bázist épít be egy fodzfodiésuzter kötés kialakításával

Az E. coli DNS polimeráz I nemcsak a polimerizációhoz szükséges 5'-3' polimeráz aktivitással rendelkezik, hanem egy 5'-3' exonukleáz és egy 3'-5' exonukleáz aktivitással is. Ezek a DNS lebontó aktivitások a legtöbb polimeráznál megtalálhatóak és fontos szerepük van a replikáció során.

E. coliban található még egy DNS polimeráz II (pol II) és egy DNS polimeráz III (pol III) enzim is. A pol II valószínüleg a javító (repair) mechanizmusokban játszik szerepet míg a pol III a replikációt végző fő enzim.

A DNS polimeráz III holoenzim több mint 20 különböző alegységból áll, tehát sokkal bonyolultabb, mint ez egy polipeptid lánc alkotta pol I. A pol III katalitikus core enzim három alegységből áll : alfa, epszilon és théta. Az enzim 3'-5' exonukleáz aktivitása fontos a hibajavításnál (proofreading, editing), mely az epszilon alegységhez kötődik. Az epszilon hiányában van polimeráz aktivitás, de nincs hibajavítás, így a szintetizált DNS szál több hibát tartalmaz (lásd : repair, mutátor gén).

Replikációs origó - a replikáció egy fix szekvenciától kezdődik és két irányba megy. E. coliban ez az oriC régió 245 bp hosszú. Szerkezetét a 11-24 ábra mutatja. A perctérképen 83 min. pozícióban helyezkesik el.
3 tandem, egy irányba mutató, nagyon hasonló 13 bp szekvencia és 4 DnaA kötőhely alkotja. Az iniciáció - kitekeredés - a DnaA fehérje kötődésével kezdődik. Ezek után épül fel a replikációs komplex.


11-24. ábra:
Az E. coli oriC régiója, a replikáció elindításához szükséges szerkezeti elemek.

Terminus vagy ter szekvenciák (terDA és terCB,) jellegzetes 23 bp szekvencia az alkotóelemük, a replikáció ezeknél áll le. A két ellentétes irányból érkező replikációs villa mindegyikének van egy ter régiója, mely túl van az ellentétes szálon érvényes ter régión. Ezek orientáció függően állítják le a replikációt.

Helikázok :
A helikázok a DNS két szálát összetartó hidrogénhidakat bontják, hogy kialakuljon a szabad templát szál. Olyan "gyalogló"fehérjéknek tekinthetők, melyek a két szál közé ékelődve haladnak előre ATP felhasználásával. Ilyenenk például az E. coli DnaB és Rep fehérjék.

Az SSB ( single strad binding) fehérjék stabilizálják a szétvált szálakat, úgy, hogy hozzájuk kötődnrk, megakadályozva ezzel az újboli összekapcsolódást.

Primosome (primoszóma)
A replikáció megkezdéséhez primerre van szükség, mely segítségével létrejön egy rövid kettős szálúszakasz. A primer egy kb. 30 bázis hosszúságú RNS molekula, melyet a primáz enzim készít. Az enzim több más fehérjével együtt alkotott komplexe a primiszóma , melyben helyet kap, többek között a DnaB, DnaT, PriA, PriB, PriC fehérje is.

Polimerizáció, vezető és követő szál:
A primerek elkészültével a pol III enzimkomplex (több mint 20 féle alegység, alfa, epszilon és theta core régió) 5'-3' irányban szintetizálja az új szálakat (50,000 bázis/ min. sebességgel). Ennek következtében az egyik templát szál (3' vége a "nyitott oldalon) "másolása" folyamatosan haladhat a replikációs villával megegyező irányban és nem igényel több primer szintézist (vezető szál vagy leading strand, 11-26 és 11-27. ábra).

A másik szál (5' vége a "nyitott oldalon) kiegészítése azonban ennél bonyolultabb, mivel az új szál szintézise a replikációs villa felől kell hogy induljon "visszafelé" ugyancsak 5'-3' irányban (11-26 és 11-27. ábra). Ezért a helikázok által újonnan szabaddá tett részeken újból és újból el kell indítani a polimerizációt ismételt primerek szintézisével. Ennek az új szálnak a szintézise tehát szakaszosan a replikáció haladási irányával ellentétesen zajlik, ezért ez a követő szál (lagging strand). A primer helyekról szakaszosan induló szintézis következtében a replikáció során rövid ideig még össze nem kapcsolódott DNS szakaszok mutathatók ki ennél a szálnál. Felfedezőjükről az Okazaki framentek elnevezést kapták.


11-26. ábra :
A replikációs villa kialakítását a helikázok végzik, az SSB fehérjék stabilizálják. A jobb oldali (3'-5' irányú) templát szálon a szintézis szakaszosan mehet végbe a replikációs villa haladásának függvényében. Az RNSprimereket a primáz enzim készíti el.


11-27. ábra:
A követő szál szakaszos szintézisének következtében az új szál még egy ideig Okazaki fragmentekből áll, melyekből a pol I és ligáz enzimek műküdése nyomán kialakul a folytonos új szál.

A pol I és a DNS ligáz szerepe:
Az Okazaki fragmentek tehát egy rövid RNS szakasszal kezdődnek, aminek az eltávolítását a pol I enzim végzi 5'-3' exonukleáz aktivitása segítségével és a helyére DNS szálat szintetizál ( 5'-3' polimeráz aktivitás ). Az Okazaki fragmentek közötti kovalens kötést azonban nem képes létrehozni. Ezt a reakciót, a hiányzó foszfodiészter kötés létrtehozását a DNS ligáz végzi el ATP felhasználásával a 11-28. ábrán látható módon.

11-28. ábra :

A DNS ligáz által katalizált reakció ATP energiájának felhasználásával helyreállítja a cukor foszfát gerinc folytonosságát (foszfodiészter kötés kialakítása).

Az enzim előbb egy aktivált ligáz-AMP formává alakul, ami elég energiával rendelkezik a kovalens kötés létrehozásához.


A replikációs villában egy enzimkomplex (repliszóma, replisome) szintetizálja mindkét új szálat, melynek felépítése a 11-30. ábrán felvázolt modell szerint képzelhető el. A követő szál szintézise a templát szál hurkolódása segítségével haladhat a replikációs villa haladási irányával megegyezően.

11-30. ábra :

A replikációs komplex modellje.

Mindkét új szál szintézise azonos irányban halad a villa nyitásával. A követő szál templátja hurkot képez a komplexen belül, hogy ez megvalósulhasson.

Topoizomerázok
A helikázok és a replikációs folyamat extra csavarodást okoznak a DNS spirálon. A topoizomeráz enzimek ezt "oldják" vagy egy "ellazult" DNS kettős helixbe extra csavarodásokat vihetenek be. Igy jöhet létre a "supercoiling" DNS például a DNS giráz működése következtében (lásd CCC plazmid forma)

Az I. típusú topoizomeráz enzimek egy szálon képesek csak megszüntetni a cukor-foszfát gerinc folytonosságát, így a "túlcsavarodott" spirál a másik, épen maradt kötés mint tengely segítségével "kipöröghet", a feszültség megszűnik.

11-31 ábra :

A DNS giráz (DNA gyrase) által katalizált változások a DNS szerkezetében. Az enzim a relaxált DNS mindkét irányú "tekercselését" képes katalizálni.





11-32. ábra :

A replikációs villa kialakulássa, a szálak szétválása a DNS molekula más részein extra felcsavarodást idéz elő. Ezt oldják az I. típusú topoizomerázok.

A II. típusú topoizomeráz enzimek mindkét szálat elvágják, ezáltal a replikáció végén "összeakadt" két új DNS gyűrű szétbontását oldják meg.

Hibajavítás (proofreading, editing) :
A pol I és a pol III is rendelkezik 3' -> 5' exonukleáz aktivitással, ami a hibásan beépített (nem komplementer) bázis azonnali kivágását szolgálja. A hibajavító funkciót a pol III esetén az epszilon alegység végzi. Ha hiányzik vagy hibás (mutáció), magasabb a mutációs ráta -> mutátor gén (lásd később repair).


Eukarióta sejtciklus

G1 (gap) -> S (szintézis) -> G2 -> M (mitózis, osztódás)

Pulzus jelöléssel (triciált timidin) sok replikációs origó lehet kimutatni egy kromoszómán belül (ARS = autonomously replicating sequences). Legalább tízszer lassabb a replikáció sebessége, mint prokariótáknál. A kromoszóma kitüntetett részei az ARS mellett a 1 db centromeron és a 2 db telomer szekvencia, melyek mindegyike szükséges a kromoszóma szabályos megkettőződéséhez és a utódkromoszómák utódsejtekbe való szétválásához.

11-35. ábra

Az eukarióta sejtciklus



- DNS felépítés - replikáció mikroszkóposan - a replikáció molekuláris biológiája - a DNS 50 éve -